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384835-53-4，18:1 BIOTINYL PE的制備方法有哪些

2025-08-08 [3]
18:1 BIOTINYL PE（生物素化的 18 碳單不飽和磷脂酰乙醇胺）是一種生物素修飾的磷脂，其中 “18:1" 指分子中含 18 碳單不飽和脂肪酸鏈（通常為油酰基，即 Δ9 - 十八碳烯酰基），“PE" 代表磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine），“BIOTINYL" 表示乙醇胺的氨基被生物素基團修飾。其制備核心是通過化學方法將生物素基團偶聯到 18:1 PE 的氨基上，常用方法如下：

一、核心原理

18:1 PE 的結構中，甘油骨架的 3 位連接磷酸乙醇胺基團，其中乙醇胺的末端含游離氨基（-NH?）；生物素分子（biotin）含羧基（-COOH），需先活化羧基使其具備與氨基反應的活性，再通過酰胺化反應與 18:1 PE 的氨基形成穩定的酰胺鍵（-CONH-），最終得到生物素化產物。

二、常用制備方法（化學合成法）

方法 1：NHS - 生物素活化法

利用 N - 羥基琥珀酰亞胺（NHS）活化生物素的羧基，生成高活性的 NHS - 生物素酯，再與 18:1 PE 的氨基反應。
步驟詳解
  1. 原料準備

    • 18:1 PE：通常為1,2 - 二油酰基 - sn - 甘油 - 3 - 磷酸乙醇胺（DOPE），因油酰基（18:1 Δ9c）是最常見的 18 碳單不飽和脂肪酸鏈，可通過商業購買或實驗室合成。

    • 生物素活化試劑：NHS - 生物素（N-hydroxysuccinimide biotin，商業可得，或自制：生物素與 NHS 在碳二亞胺如 DCC 催化下反應生成）。

    • 溶劑：選用磷脂和生物素衍生物均溶解的有機溶劑，如氯仿 / 甲醇混合液（體積比 2:1） 或二氯甲烷。

    • 催化劑：加入有機堿（如三乙胺）中和反應生成的酸，促進酰胺化反應。

  2. 反應過程

    • 將 DOPE（1 eq）溶于上述溶劑，加入過量的 NHS - 生物素（1.2-1.5 eq，過量提高反應率），再滴加少量三乙胺（1-2 eq）。

    • 室溫下攪拌反應 4-12 小時（可通過 TLC 監測反應進度，展開劑用氯仿 / 甲醇 / 水 = 65:25:4）。

    • 反應原理：NHS - 生物素的酯基與 DOPE 的氨基反應，釋放 NHS，形成生物素 - PE 酰胺鍵。

  3. 產物純化

    • 反應結束后，旋蒸除去溶劑，殘留固體用少量氯仿溶解。

    • 通過硅膠柱層析純化：以氯仿 / 甲醇混合液（初始比例 9:1，逐步提高甲醇比例至 7:3）為洗脫劑，收集含目標產物的流分（TLC 檢測，Rf 值低于原料 DOPE，因生物素增加極性）。

    • 合并純流分，旋蒸干燥，得到白色或類白色固體產物 18:1 BIOTINYL PE。

方法 2：EDC/NHS 聯用活化法

若直接使用生物素（而非 NHS - 生物素），可通過 1 - 乙基 - 3-（3 - 二甲基氨基丙基）碳二亞胺（EDC）活化羧基，同時加入 NHS 穩定活化中間體，提高反應效率。
步驟要點

  1. 溶劑選用DMF（二甲基甲酰胺）或氯仿 / 甲醇混合液，避免水過多（EDC 在水中易水解）。

  2. 依次加入 DOPE（1 eq）、生物素（1.2 eq）、EDC（1.5 eq）、NHS（1.5 eq），室溫攪拌 8-16 小時。

  3. 純化步驟同方法 1（硅膠柱層析）。

方法 3：酶促合成法（輔助方法）

利用脂肪酶或酰胺合成酶催化生物素與 18:1 PE 的偶聯，適用于對化學試劑敏感的場景，但效率較低，較少用于大規模制備。


  • 條件：在緩沖液（如 PBS，pH 7.0-7.5）中，加入酶（如胰脂肪酶）、DOPE 和生物素，37℃反應 24-48 小時。

  • 缺點：反應速率慢，副產物較多，需嚴格控制酶活和 pH。

三、關鍵注意事項

  1. 溶劑選擇：需兼顧磷脂（疏水性）和生物素衍生物（中等極性）的溶解性，避免使用強極性溶劑（如純水）導致磷脂析出。

  2. 反應條件：控制溫度（室溫為宜，高溫可能導致磷脂氧化或生物素分解）和 pH（弱堿性環境利于氨基親核攻擊）。

  3. 純化驗證：通過核磁共振（1H NMR，檢測生物素特征峰 δ 4.3-4.5）、質譜（ESI-MS，目標分子量約 1000-1100 Da）確認產物結構。

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