以下是牛血清蛋白偶聯(lián)黃體酮的幾種常見制備方法：

活潑酯法

• 原理：先將黃體酮進(jìn)行化學(xué)修飾，引入羧基等活性基團(tuán)，然后與牛血清蛋白上的氨基通過活潑酯反應(yīng)形成酰胺鍵，實(shí)現(xiàn)偶聯(lián)。

• 步驟：將黃體酮半抗原溶解于N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，再分別將N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽（EDC）溶解于DMF，使三者的摩爾比為1:2:2。室溫下，磁力攪拌器攪拌12～16小時，轉(zhuǎn)速為250～300rpm，使半抗原上的羧基充分活化。冰浴下，緩慢攪拌，逐漸滴加活化的半抗原到5～7mg/mL的牛血清白蛋白（BSA）中，使DMF在溶液的最終濃度為20～25％。低溫下緩慢攪拌偶聯(lián)12～16小時，將半抗原和載體蛋白的偶聯(lián)物裝入透析袋中，4℃下透析三天，一天換3次PBS（0.01M；pH 7.4）除去多余的DMF。最后，10,000～12,000rpm，4℃下離心10min，棄沉淀，取上清，使用BCA蛋白定量試劑盒測量濃度，分裝于EP管中，儲存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

碳二亞胺法

• 原理：碳二亞胺類化合物作為脫水劑，促進(jìn)羧基和氨基之間形成酰胺鍵?？商鎸幏肿又写嬖隰然然钚曰鶊F(tuán)，牛血清蛋白上有豐富的氨基，利用碳二亞胺使兩者發(fā)生縮合反應(yīng)，從而實(shí)現(xiàn)偶聯(lián)。

• 步驟：首先將可替寧和牛血清蛋白分別溶解在合適的緩沖液中，然后將碳二亞胺試劑（如EDC，即1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽）加入到可替寧溶液中，活化一段時間后，將活化后的可替寧溶液緩慢滴加到牛血清蛋白溶液中，在一定的溫度和pH條件下攪拌反應(yīng)數(shù)小時。反應(yīng)結(jié)束后，通過透析或凝膠過濾等方法去除未反應(yīng)的物質(zhì)和雜質(zhì)，得到可替寧-牛血清蛋白共軛物。

戊二醛法

• 原理：戊二醛是一種雙功能交聯(lián)劑，能夠與蛋白質(zhì)分子中的氨基發(fā)生反應(yīng)，形成席夫堿結(jié)構(gòu)，從而將兩個蛋白質(zhì)分子連接起來。

• 步驟：把牛血清蛋白溶解在緩沖液中，加入適量的戊二醛溶液，在一定溫度下攪拌反應(yīng)一段時間，使牛血清蛋白分子之間發(fā)生輕度交聯(lián)，這樣可以增加蛋白的反應(yīng)活性位點(diǎn)。然后將可替寧加入到上述反應(yīng)體系中，繼續(xù)在適宜的條件下反應(yīng)數(shù)小時。反應(yīng)完成后，同樣需要進(jìn)行純化處理，以獲得純凈的共軛物。

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