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疊氮修飾的生物素有哪些應(yīng)用

2025-01-17 [69]

1.生物分子標(biāo)記與檢測

  • 蛋白質(zhì)標(biāo)記

    • 利用疊氮修飾的生物素可以對蛋白質(zhì)進(jìn)行特異性標(biāo)記。例如,在細(xì)胞內(nèi),通過基因工程技術(shù)將非天然氨基酸(含有炔烴官能團)引入目標(biāo)蛋白質(zhì)中。然后,疊氮修飾的生物素與這種帶有炔烴的蛋白質(zhì)在銅(I)催化劑的作用下發(fā)生點擊化學(xué)反應(yīng)(銅催化的疊氮 - 炔烴環(huán)加成反應(yīng),CuAAC),將生物素標(biāo)記到蛋白質(zhì)上。

    • 標(biāo)記后的蛋白質(zhì)可以利用生物素與親和素(avidin)或鏈霉親和素(streptavidin)之間的高親和力( - M 左右)進(jìn)行檢測。例如,在 Western blotting 實驗中,將標(biāo)記有生物素的蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行電泳分離后,轉(zhuǎn)移到膜上,用親和素或鏈霉親和素標(biāo)記的酶(如辣根過氧化物酶,HRP)與之結(jié)合,通過酶催化底物顯色反應(yīng)來檢測蛋白質(zhì)的存在和表達(dá)量。

  • 核酸標(biāo)記

    • 對于核酸,可在合成寡核苷酸時引入炔烴修飾的堿基。隨后,疊氮修飾的生物素與這些炔烴修飾的核酸發(fā)生點擊反應(yīng),實現(xiàn)核酸的生物素化。

    • 標(biāo)記后的核酸可以用于原位雜交(ISH)等技術(shù)。例如,在熒光原位雜交(FISH)中,生物素化的核酸探針與細(xì)胞內(nèi)的目標(biāo)核酸序列雜交后,用熒光標(biāo)記的親和素或鏈霉親和素進(jìn)行檢測,從而實現(xiàn)對特定核酸序列在細(xì)胞內(nèi)的定位和定量分析。

2.生物分子相互作用研究

  • 蛋白質(zhì) - 蛋白質(zhì)相互作用

    • 可以將兩種感興趣的蛋白質(zhì)分別用不同的標(biāo)記進(jìn)行修飾。例如,一種蛋白質(zhì)用疊氮修飾的生物素標(biāo)記,另一種用含有炔烴的熒光分子標(biāo)記。通過 CuAAC 反應(yīng)使它們偶聯(lián),在活細(xì)胞或體外環(huán)境中研究它們之間的相互作用。

    • 利用生物素 - 親和素系統(tǒng)的高親和力,結(jié)合熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)或生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移(BRET)技術(shù),能夠更精確地檢測蛋白質(zhì) - 蛋白質(zhì)相互作用的動態(tài)變化。例如,當(dāng)兩種標(biāo)記后的蛋白質(zhì)相互靠近發(fā)生相互作用時,F(xiàn)RET 或 BRET 信號會發(fā)生變化,通過檢測這種信號變化來研究相互作用的強度和時間進(jìn)程。

  • 蛋白質(zhì) - 核酸相互作用

    • 用疊氮修飾的生物素標(biāo)記蛋白質(zhì),用炔烴修飾核酸,研究它們在轉(zhuǎn)錄、復(fù)制等過程中的相互作用。例如,在研究轉(zhuǎn)錄因子與 DNA 啟動子區(qū)域的相互作用時,將轉(zhuǎn)錄因子蛋白進(jìn)行生物素標(biāo)記,DNA 啟動子區(qū)域進(jìn)行炔烴修飾,通過它們之間的點擊反應(yīng)和后續(xù)的檢測來確定相互作用的位點和親和力。

3.生物分子純化

  • 親和層析

    • 親和層析是一種基于生物分子之間特異性相互作用的分離技術(shù)。將疊氮修飾的生物素化的目標(biāo)分子(如蛋白質(zhì)或核酸)與固定在層析柱上的親和素或鏈霉親和素結(jié)合。由于它們之間的高親和力,目標(biāo)分子能夠被有效地吸附在柱子上。

  • 然后通過改變洗脫條件(如 pH、離子強度或加入競爭劑),可以將目標(biāo)分子從柱子上洗脫下來,從而實現(xiàn)對目標(biāo)分子的純化。例如,在重組蛋白的純化中,如果目標(biāo)蛋白已經(jīng)被疊氮修飾的生物素標(biāo)記,將細(xì)胞裂解液通過親和素 - 瓊脂糖層析柱,目標(biāo)蛋白就會結(jié)合在柱子上,經(jīng)過洗滌和合適的洗脫步驟后,得到純化的目標(biāo)蛋白。

4.藥物研發(fā)與靶向治療

  • 藥物遞送系統(tǒng)

    • 可以將藥物分子與疊氮修飾的生物素結(jié)合,或者將生物素 - 藥物復(fù)合物連接到含有炔烴的載體(如納米顆粒)上。這種修飾后的藥物遞送系統(tǒng)可以利用生物素與細(xì)胞表面受體(如某些癌細(xì)胞表面高表達(dá)的親和素相關(guān)受體)的相互作用,實現(xiàn)藥物的靶向遞送。

藥物篩選與評價

  • 利用生物素 - 親和素系統(tǒng)構(gòu)建高通量藥物篩選模型。例如,將藥物靶點蛋白用疊氮修飾的生物素標(biāo)記,固定在芯片或微孔板表面,然后將小分子藥物庫中的化合物與這些標(biāo)記的靶點蛋白進(jìn)行相互作用測試。

  • 通過檢測生物素 - 親和素結(jié)合信號的變化來篩選出與靶點蛋白有高親和力的藥物候選物,從而加速藥物研發(fā)的進(jìn)程。

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